再谈核苷类似物

从生物化学、药物化学的角度解释核苷类似物如何磷酸化，Acyclovir、Lamivudine 如何发挥抗病毒作用。再谈 Lamivudine、Tenofovir 是否对 COVID 有效。

核苷类似物（nucleoside analogue）主要用作抗病毒药物，也有抗癌、分子生物学研究等用途：

• 生活中最常见到的应该是阿昔洛韦（Acyclovir），毕竟疱疹病毒（HSV）相对常见。
• 电影《达拉斯买家俱乐部》中出现了齐多夫定，是治疗 HIV 的药物。
• 分子生物学的一代测序中，使用 ddNTP 来随机终止 DNA 链。

之前写过一篇简单介绍核苷类似物的 blog，但感觉写得有点烂，所以重新写一下。上次有两个问题没有解决：

• 问题 1：为什么相比 dC，Lamivudine 的手性是反的？
• 问题 2：为什么 Lamivudine、Tenofovir 既能抑制 DNA 病毒，又被认为能抑制 RNA 病毒？

Lamivudine（拉米夫定，3TC）构型比较怪，并且两个问题都涉及；Acyclovir（阿昔洛韦，ACV）和 TK 有关；所以本文主要介绍这两种核苷类似物。另外，还要用循证医学解释 Lamivudine、Tenofovir 是否对 COVID 有效。

1. 背景介绍

首先介绍一下本文涉及的蛋白质、常见病毒、核苷类似物。

1.1 蛋白质

本文主要涉及的蛋白质：

• 核苷激酶 dNK
• 聚合酶 DdDp、DdRp、RdDp、RdRp

蛋白质的四级结构：

• 一级结构：氨基酸序列
• 二级结构：局部的空间构象，主要是指 α-螺旋、β-折叠
• 三级结构：单个亚基不同位置的相互作用
• 四级结构：多个亚基之间的相互作用

氨基酸对照表

因为后文会提到氨基酸，所以这里先列出来。

标准蛋白氨基酸列表 - 维基百科

DNA密码子表 - 维基百科

氨基酸对照表（部分）：

氨基酸名称	三字母	一字母
谷氨酸	Glu	E
苯丙氨酸	Phe	F
酪氨酸	Tyr	Y
丙氨酸	Ala	A
精氨酸	Arg	R
天冬酰胺	Asn	N
谷氨酰胺	Gln	Q
甲硫氨酸	Met	M
缬氨酸	Val	V
异亮氨酸	Ile	I

突变表示的示例：突变 M184V 表示 DNA/RNA 的突变导致蛋白质 184 位的 Met 变成了 Val。

1.2 病毒

本文主要涉及的病毒：HSV、HIV、HBV、SARS-CoV-2。

一些常见的病毒、现有的药物治疗方法：

中文名	简称	Baltimore 分类	复制酶	核苷类似物	其他药物
单纯疱疹病毒	HSV	1 双链 DNA（dsDNA）	DNAP	阿昔洛韦，泛昔洛韦，伐昔洛韦
人类免疫缺陷病毒	HIV	6 正单链 RNA 逆转录（ssRNA-RT）	RT（具有 RdDp, DdDp 功能）	TDF，恩曲他滨 FTC, 3TC	NNRTI：依非韦伦 EFV，奈韦拉平 NVP DTG
乙型肝炎病毒	HBV	7 双链 DNA 逆转录（dsDNA-RT）	RT（具有 RdDp, DdDp 功能）	TDF，恩替卡韦 ETV，替比夫定， 3TC，阿德福韦 ADV
丙型肝炎病毒	HCV	4 单链 RNA（(+)ssRNA）	RdRp	Sofosbuvir	DAA：维帕他韦
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2	SARS-CoV-2	4 单链 RNA（(+)ssRNA）	RdRp	瑞德西韦，莫诺拉韦	3CLpro 抑制剂：奈玛特韦、利托那韦

没认真查指南，列出的药物不一定对。

针对 HIV RT 的药物主要包括两类：

• NRTI 一般作为链终止剂
• NNRTI 一般作为非竞争性抑制剂

[1] Insights into HIV-1 Reverse Transcriptase (RT) Inhibition and Drug Resistance from Thirty Years of Structural Studies

1.3 核苷类似物

最常见的碱基有五种：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶。碱基和核糖结合起来就是核苷。

本文涉及的核苷类似物：

• Lamivudine
• Tenofovir
• Acyclovir

本文只关注药效，不关注药动。所以不区分核苷类似物和核苷酸类似物，不特别区分 TDF 和 Tenofovir。

常见的核苷类似物

大部分是 wiki 上列出的。加粗表示天然存在的核苷、脱氧核苷

腺苷类

中文名	英文名	缩写	结构式	描述
脱氧腺苷	Deoxyadenosine	dA
肌苷 次黄苷	Inosine	I
地达诺新 双脱氧肌苷	Didanosine	ddI		I 少了两个羟基
阿糖腺苷	Vidarabine	ara-A		A 改成阿拉伯糖（2’ 羟基手性异构）
腺苷	Adenosine	A
	Galidesivir			dA 的基础上，NH 取代 O，嘌呤环变了
瑞德西韦	Remdesivir			A 的基础上加了个氰基，5’-OH 连酯基。嘌呤也变了
替诺福韦	Tenofovir	TFV (TDF, TAF)		AMP 酯化。去掉 O C，开环，加甲基。

胞苷类

中文名	英文名	缩写	结构式	描述
胞苷	Cytidine	C
阿糖胞苷	Cytarabine	ara-C		C 改成阿拉伯糖
吉西他滨	Gemcitabine			C 的 2’ 改成两个 F
脱氧胞苷	Deoxycytidine	dC
	Zalcitabine	ddC		dC 上再去掉一个羟基
拉米夫定	Lamivudine	3TC		dC 的基础上把羟基改成环上的 S，并且手性变了两个
恩曲他滨	Emtricitabine	FTC		3TC 的基础上加一个 F

鸟苷类

中文名	英文名	缩写	结构式	描述
鸟苷	Guanosine	G
利巴韦林	Ribavirin			G 的嘌呤变成三氮唑+酰胺
阿昔洛韦	Acyclovir	ACV		G 的 2’ 3’ 碳去掉
更昔洛韦	Ganciclovir	GCV		Acyclovir 再加一条链
恩替卡韦	Entecavir	ETV		dG 糖上的 O 变成双键
阿巴卡韦	Abacavir	ABC		G 的嘌呤的 O 变成了环丙基 NH，糖部分类似 d4T（变成双键），并且 O 变成 C
脱氧鸟苷	Deoxyguanosine	dG

胸苷、尿苷类

中文名	英文名	缩写	结构式	描述
胸苷 脱氧胸苷	Thymidine	dT
碘苷	Idoxuridine			dT 的甲基变成 I
替比夫定	Telbivudine			dT 环沉下去了（类似 3TC）
司他夫定	Stavudine	d4T		dT 上 2’, 3’ 变成双键
齐多夫定	Zidovudine	ZDV, AZT		dT 上的 3’ 变成叠氮
脱氧尿苷	Deoxyuridine	dU
三氟胸苷	Trifluridine	TFT		胸苷的甲基变成 CF3

2. dNK 与 Acyclovir

在讨论 Acyclovir 之前，需要先介绍核苷激酶 dNK。

2.1 核苷激酶 dNK

核苷激酶（dNK）可以向脱氧胸苷（dN）上加一个磷酸：

$$ \ce{\text{dN} + ATP ->[\text{dNK}] \text{dNMP} + ADP} $$

后面变成 dNTP 还需要两个激酶（本文不讨论）：

$$ \begin{gather*} \ce{\text{dNMP} + ATP ->[\text{dNMP kinase}] \text{dNDP} + ADP} \\ \ce{\text{d}NDP + ATP ->[NDPK] \text{d}NTP + ADP} \end{gather*} $$

dNK 的种类：

• 人 17 号染色体上的 TK1，几乎只磷酸化 dT
• 人线粒体上的 TK2，可以磷酸化 dT、dC
• 单纯疱疹病毒的 HSV1-TK 可以磷酸化 dT、dC、dG

人体除了 TK1、TK2，还有脱氧胞苷激酶（hdCK）、线粒体中的脱氧鸟苷激酶（hdGK）。似乎还有 UCK2。

正常人 S 期细胞表达 TK1，通过补救途径合成 dTTP，用于 DNA 复制。

HSV 为什么有胸苷激酶

疱疹病毒没有胸苷激酶能活吗？

HSV 的 TK 基因对于饥饿细胞是必要的，但对于活跃细胞中的病毒复制不是必需的 [2]。
HSV 缺失 TK 基因后毒力（致病力，Virulence）降低 [3]。

所以，HSV 自备一个 TK 基因能够在任何细胞周期保证核苷激酶的活性，有更高的传播速率。

[2] Induction of Both Thymidine and Deoxycytidine Kinase Activity by Herpes Viruses
[3] Alpha-Herpesvirus Thymidine Kinase Genes Mediate Viral Virulence and Are Potential Therapeutic Targets

催化机制

脱氧核苷激酶具有保守的 Glu-Arg pair。

• 谷氨酸（Glu）是酸性氨基酸（等电点 pI = 3.15）
• 精氨酸（Arg）是碱性氨基酸（等电点 pI = 10.76）

两者之间可以形成 蛋白质中的盐桥。

估计然后是：碱性氨基酸带正电，酸性氨基酸带负电，可以形成电场，让氢离子更容易飞掉。dNK 的 P-loop 与 ATP 的磷酸基团结合，dN 和 ATP 发生 SN2 亲核取代反应（NTR 取代）。

dNK 与核苷类似物结合

为啥在细胞内，阿昔洛韦（鸟苷类似物）能与脱氧核苷竞争病毒胸腺激酶或细胞激酶？

HSV1-TK 的二聚体具有催化活性。更昔洛韦（Ganciclovir）可以结合到 HSV1-TK 上：

3TC 和 ADP 可以结合到人脱氧胞苷激酶（dCK）上：

dNK 对核苷类似物的催化效果

TK1、TK2、dCK、dGK、HSV1-TK 催化各种底物的 Kcat/Km：

在米氏方程中，Kcat/Km 用于衡量酶对底物的偏好程度。

HSV1-TK 处理 Acyclovir 的 Kcat/Km 大约是 10^2 的量级，勉强能反应。而人的 TK1、TK2 无法催化 Acyclovir。

鸟苷（G）在环上多了一个 OH，形成了氢键，所以亲和力高。估计 Ganciclovir 也是因为多了一个 OH，Kcat/Km 有提升。

[4] Human and viral nucleoside/nucleotide kinases involved in antiviral drug activation: Structural and catalytic properties

2.2 Acyclovir 的药理

Acyclovir 在被消化系统吸收后，会进入血液，分布到组织中，然后可能是通过核苷转运蛋白易化扩散进入细胞。在细胞内，进行三次磷酸化，形成活性的三磷酸核苷，然后与病毒的复制酶结合，加入到 DNA 链上，阻止 DNA 链的延伸。

因为 ACV 的第一次磷酸化只能由 HSV1-TK 进行，而不能被人体核苷激酶进行，所以 Acyclovir 只作用于被 HSV 感染的细胞。

并且，相比细胞 DNA 聚合酶，ACV-TP 更倾向于结合病毒 DNA 聚合酶，终止 DNA 链。

[5] 简明药物化学

3. 聚合酶与 Lamivudine

先谈聚合酶，解释为什么复制时 DNAP 对 dNTP、转录时 RNAP 对 NTP 具有选择性。再谈 Lamivudine 的构型、结合方式。

聚合酶的作用是将核苷酸链合成 DNA 或 RNA：

$$ \begin{gather*} \ce{DNA_{n} + \text{dNTP} ->[\text{DNAP}] DNA_{n+1} + PP_{i}} \\ \ce{RNA_{n} + NTP ->[\text{RNAP}] RNA_{n+1} + PP_{i}} \end{gather*} $$

3.1 DNAP、RNAP 如何区分 dNTP、NTP

转录时，RNA聚合酶如何分辨脱氧核苷酸和核糖核苷酸？

TLDR：RNAP 依靠氢键之类的相互作用、NTP 的浓度区分 dNTP 和 NTP，而 DNAP 则依靠位阻区分两者。

DNA 聚合酶（DNAP、DdDp）

真核生物中，细胞核 DNA 复制主要由 DNAP α、δ、ε 完成。

在酿酒酵母菌中，核糖核苷三磷酸（NTP）的浓度是 500-3000 μM，脱氧核苷三磷酸（dNTP） 的浓度是 12-30 μM，NTP/dNTP 介于 36-190 之间。它的 DNA 聚合酶ε 可能会把 NTP 当作 dNTP 使用。[6]

人类线粒体中 DNAP γ 对 dTTP/UTP 的选择性大约为 77000，而对 dGTP/GTP 的选择性大约为 1100 [7]。

DNA 聚合酶主要通过较大的侧链残基（如 Glu、Phe、Tyr），构成 steric gate，在空间上阻断核糖环的 2’-OH [8]。

一些生物的 DNAP 和 ddNTP 结合的位点（C2’ 表示核糖环的 2’ 位碳原子）：

对于聚合酶 Dpo4，酪氨酸比较大，ATP 的 2’-OH 会被排除，只允许 dATP 反应。Y12A 突变后，变成了丙氨酸，NTP 可以进入。

[6] Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases
[7] Ribonucleotide Discrimination and Reverse Transcription by the Human Mitochondrial DNA Polymerase
[8] Unlocking the Sugar ‘Steric Gate’ of DNA Polymerases

RNA 聚合酶（RNAP、DdRp）

RNA 聚合酶 II 主要用于合成 mRNA。

RNAP 的选择性一方面和细胞内 NTP 的浓度有关（上文已说明），另一方面和 RNAP 的结构有关。

T7 噬菌体的 RNAP

T7 噬菌体的 RNAP 是单亚基的，比较简单。它使用 NTP 的效率是 dNTP 的 70-80 倍。[9]

Y639F 突变导致 dNTP 掺入量增加 20 倍，说明 639 位的 Tyr 对区分 NTP 和 dNTP 有重要作用 [10] [11]。

Tyr 和 NTP 之间夹了一个 $\ce{Mg^2+}$，猜测是两个羟基上的氧原子带负电荷，可以与 $\ce{Mg^2+}$ 吸引 [10]。

[9] Mechanism of Ribose 2‘-Group Discrimination by an RNA Polymerase
[10] Structural Basis for Substrate Selection by T7 RNA Polymerase
[11] The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm

真核生物的 RNAP

多亚基 RNAP 选择性的具体机制不太清楚，可能是通过 β′Arg425、β′Asn458、β′Gln929 的氢键来区分 NTP 和 dNTP 的 [7]。

这里又说 T7 RNAP 是通过氢键来区分的，而不是和 $\ce{Mg^2+}$ 的配位键。不知道哪个对。

[12] The mechanism of the nucleo-sugar selection by multi-subunit RNA polymerases

3.2 Lamivudine

回答问题 1：Lamivudine 的构型（手性）

问题 1：为什么相比 dC，Lamivudine 的手性是反的？

在 表格 中，可以发现其他药物也有类似的设计（说明不是打印错了）：

• 替比夫定和 dT 除了手性没有区别
• FTC 和 3TC 只有嘧啶上的 F 的区别

Lamivudine 的化学名是 (-)-L-2′,3′-dideoxy-3′-thiacytidine。

(+)-3TC 被 HIV RT 掺杂进入 DNA 的效率更高。但实际使用 (-)-3TC，可能是因为毒性更低、RNase H 降解速率低、稳定性高 [13] [14]

[13] Mechanistic Studies Comparing the Incorporation of (+) and (−) Isomers of 3TCTP by HIV-1 Reverse Transcriptase
[14] Perspectives on the molecular mechanism of inhibition and toxicity of nucleoside analogs that target HIV-1 reverse transcriptase

上面说了 (-)-3TC 更有效，但没有解释原因。下面详细说明 Lamivudine 对 HBV/HIV RT 的结合方式相比 dC 有什么不同。

Lamivudine 如何与 HBV/HIV RT 结合

恩替卡韦容易耐药吗？

3TC、恩替卡韦 ETV、Tenofovir 是常见的 HBV 药物。HBV 一个 M204V/I、HIV 一个 M184V/I 突变就能把 Lamivudine 打趴下（耐药），这类突变也会让 ETV 部分耐药。

HBV RT 溶解度差，蛋白质结构解析不出来。所以在 HIV 上做一些突变得到 HIV 3MB，来模拟 HBV。然后用 X 射线衍射计算蛋白质结构。

发现 3TC 与 HIV 3MB 的结合有以下特点：

• 与 RT 的 $\ce{Mg^2+}$ 结合：ETV-TP 结合方式和 dNTP 相同，磷酸占了 $\ce{Mg^2+}$ 八面体配位的三个方向。而 3TC-TP 前两个磷酸是倒过来结合的。
• 与 DNA 的作用：因为 3TC-TP 的 ɑ 磷酸距离 DNA 的 3’-OH 比较远，所以不能掺杂进入 DNA，所以是竞争抑制剂，而不是链终止剂。
• 与 RT Met184 的位阻：因为 3TC 的 S 原子、ETV 的双键的位阻作用，Met184 的构象被推了出去。如果 HIV 3MB 发生了 M184V/I 突变，就会有位阻，无法有效 dock（似乎这里 docking 才是更规范的写法）。

Tenofovir 不含核糖环（类似 Acyclovir），所以对 M184V 不敏感。

[15] Structural features in common of HBV and HIV-1 resistance against chirally-distinct nucleoside analogues entecavir and lamivudine

HIV RT M184V 突变后 Kp/Kd 显著减小，对 (-)-3TC (-)-FTC 的亲和力显著减小。突变后距离太近，有位阻。

[16] Elucidating molecular interactions of L-nucleotides with HIV-1 reverse transcriptase and mechanism of M184V-caused drug resistance

回答问题 2

问题 2：为什么 Lamivudine、Tenofovir 既能抑制 DNA 病毒，又被认为能抑制 RNA 病毒？

先纠正一点：HIV 是 RNA 病毒；HBV 虽然是 DNA 病毒，但是有 RT。

至于有人说 Lamivudine、Tenofovir 可以和 SARS-CoV-2 的 RdRp 结合。个人认为是可能的，前面问题 1 手性不一样都能塞进去，只能说能 dock 上就行。

有些药物有多种看起来更不相关的作用。比如甲氨蝶呤能抗癌，也能用来治疗类风湿性关节炎（RA）。

4. 循证医学

至于 Lamivudine、TDF 对于 COVID 临床是否有效，需要循证医学。
现有的指南没有提到这两种药物，所以需要查综述、RCT。

综述说可能有用。

[17] Effectiveness of Drug Repurposing and Natural Products Against SARS-CoV-2: A Comprehensive Review
[18] Navigating the COVID-19 Therapeutic Landscape: Unveiling Novel Perspectives on FDA-Approved Medications, Vaccination Targets, and Emerging Novel Strategies

我不太会看 RCT，感觉就是有的说在某些情况下有效果，有的说不显著。

[19] Daily tenofovir disoproxil fumarate/emtricitabine and hydroxychloroquine for pre-exposure prophylaxis of COVID-19: a double-blind placebo-controlled randomized trial in healthcare workers
[20] Effectiveness of rosuvastatin plus colchicine, emtricitabine/tenofovir and combinations thereof in hospitalized patients with COVID-19: a pragmatic, open-label randomized trial

5. 总结

• Acyclovir：ACV 可以被病毒激酶 HSV1-TK 变成 ACV-MP，从而只在病毒感染的细胞中发挥链终止剂的作用。
• DNAP、RNAP：RNA 聚合酶依靠氢键之类的相互作用、NTP 的浓度区分 dNTP 和 NTP，而 DNA 聚合酶依靠位阻区分两者。
• Lamivudine：因为 3TC 是 L 构型，3TC-TP 与 HBV RT 的结合方式与 dCTP 的结合方式不同，降低了毒性，但也导致更容易耐药（M184V 突变）。
• 循证医学：目前的指南、综述不认为 3TC、TDF 对 COVID 有效。

6. 杂谈

当时因为 COVID，我开始了解药物。在学习一些药理学、有机化学、生物化学、药物化学、循证医学之后，终于能对当初困惑的问题给出完整的解答。

关于新冠

在上一篇 blog 之后，出现了一些新的毒株。

新毒株

毒株的代号可以在 lineage_notes.txt 中查看。 病毒学家在 cov-lineages/pango-designation 仓库中讨论命名过程，sars-cov-2-variants/lineage-proposals 似乎也用于讨论。

在上次中国 2022 年 12 月 BA.5.2, BF.7 流行之后，

BA = B.1.1.529 = Omicron
BF = BA.5.2.1

2023 年 5 月 - 9 月，流行 XBB 和 EG.5 及其亚分支。

BJ = BA.2.10.1
BM = BA.2.75.3
EG = XBB.1.9.2
XBB = BJ.1, BM.1.1.1

后来，2023 年 8 月出现了 BA.2.86，2024 年 3 月流行 JN.1，而 2024 年 8 月主要是 KP.2

JN = BA.2.86.1
KP = JN.1.11.1

参考：全国新型冠状病毒感染疫情情况（2025年1月）

听说最近南非又出了一个 BA.3.2，或许几个月后会流行。

如何应对

新冠主要通过接触、飞沫、气溶胶传播。

个人可以采取的措施：戴口罩、洗手（尤其是高峰期），空气净化器、CR box。

我制作过 CR box、CO2 浓度检测仪（下次可以写一个 blog）。
但学校人太多了，挺困难的，很多时候我也做不好。

公共卫生

有时候感觉很无力。个人认为采取公共卫生措施预防呼吸道传染病，而不是交给临床医学来治病，才是（对个人）更健康、（对社会）更经济的选择。不过像 2022 年的严密封控也是不太能接受的。并且现在大部分国家都躺平了。

可能只能说有点过于现代化了，交通过于发达了，公共卫生没有跟上经济发展的步伐。

关于化学

再次遇见化学，

• 我想起了初中时烧白磷的化学实验（当然高中就没有了）；
• 想起了大约 10 年前看有机化学书，知道苯环上的定位基效应的那个夜晚；
• 想起高中时准备过三个星期的化学竞赛，当然结果是考不出来；
• 想起大一的时候搞不懂无机化学中的多原子分子轨道。

关于生物化学

感谢刘不言老师的生物化学。他是一名协和医学博士，后投身医学教育。在他的文字、视频中，有时会出现关于生死的讨论：

我说过去的一年，我有三位同学去世了。没准过几年，你听到我也会出什么事。——医生或护士从医院辞职后，过得还好吗？

一语成谶，他预言了自己的死亡——2021 年在安徽因为车祸去世。默哀。

很多疾病和生物化学有关。比如

• 蚕豆病是因为磷酸戊糖途径中的 G6PD 酶不能正常工作，容易溶血。
• 镰刀型细胞贫血症是因为基因突变导致珠蛋白上有疏水基团，疏水基团相互之间结合。

一些生活中的现象也与生物化学有关，比如

• 酸奶是粘稠的，是因为酪蛋白的等电点是酸性的。
• 绿叶菜烧熟后会变成深绿色，和去镁叶绿素有关。

关于药物化学

很多时候，药物的分子结构决定了其药动、药效性质：

• 常见的抗生素头孢呋辛酯，做成酯能够提高脂溶性，更容易吸收。
• 鼻炎会用到的丙酸氟替卡松，肝脏代谢后硫酯键断开，快速失活。
• 雷洛昔芬可以被用于治疗乳腺癌。它的侧链使得共激活因子无法盖住，无法转录。

想必看完了本文，了解了生物化学、药物化学，应该能知道下图讲的是一个 Morphine 酱和受体 dock 的故事吧。

插画：morphine-chan is working

[21] Molecular recognition of morphine and fentanyl by the human μ-opioid receptor

时间

资料查阅：

• 生物化学：2024 年 8 月
• 循证医学：2024 年 11 月
• 药物化学：2024 年 12 月，2025 年 1 月

发布：2025 年 3 月